HOMEOSTASIS ÓSEA Y BIFOSFONATOS
ENFOQUE EN APOPTOSIS

Transcripción de la conferencia efectuada en el congreso de la Sociedad
Argentina de Osteoporosis en el año 2002, corregida por la autora en XII 2004.
(Centro de Osteoporosis y Enfermedades Metabólicas de Hueso, Universidad de
Arkansas de Ciencias Médicas, Arkansas USA) .

Esta interesante conferencia la hemos presenciado en el Congreso Argentino de Osteoporosis. Ella nos de una visión diferente y con mucha fisiopatología de la acción de los bifosfonatos sobre los diferentes grupos celulares del hueso.

“Los osteoblastos, las células que forman hueso, derivan del linaje mesenquimal; y los osteoclastos, las células que resorben hueso, derivan del linaje hematopoyético de la médula ósea.

¿Cuál es el destino de estas células después de haber cumplido con su misión? Trabajos de los últimos 5-8 años demuestran que tanto los osteoclastos como los osteoblastos mueren por apoptosis o muerte celular programada. El 100% de los osteoclastos sufren apoptosis. Mientras que la mayoría de los osteoblastos, entre el 50 y 70 %, desaparece de los lugares de formación activa de hueso y también muere por apoptosis. Los osteoblastos que sobreviven se diferencian y forman o bien “lining cells”, que recubren la superficie de hueso que no está siendo resorbido u osteocitos, que quedan encerrados en la matriz ósea que luego se calcifica.

Trabajos de distintos grupos de investigación, en particular de nuestro Centro de Investigaciones, demuestran que la velocidad de apoptosis de las células de hueso es afectada por hormonas, factores de crecimiento y citokinas, así como señales mecánicas. Por lo tanto la regulación del proceso apoptótico ha ampliado las posibilidades de tratamiento de la osteoporosis.

Los osteocitos, que aparentemente están encerrados por el hueso, en realidad se comunican entre sí y existe un sincitio funcional entre osteocitos, las células que están en la superficie ósea (los osteoblastos y los osteoclastos) y las células que recubren las paredes de los vasos sanguíneos. Por lo tanto, se piensa que los osteocitos son los candidatos ideales para controlar las respuestas del hueso a las señales hormonales que vienen de la sangre y también a las señales mecánicas.

Las dos funciones fundamentales que se le atribuyen al sincitio de osteocitos son:

1) Detectar cambios en los estímulos mecánicos a los que el hueso es expuesto y emitir señales a las celulas encargadas del remodelado óseo (osteoblastos y osteoclastos). Como resultado, el hueso se adapta a las necesidades mecánicas respondiendo con cambios en la velocidad de formación o resorción ósea.

2) Detectar el microdaño en el hueso, inducido por fatiga y emitir señales que lleven a la reparación ósea en el sitio requerido.

Análisis estadísticos han demostrado que son varios los parámetros que contribuyen a la calidad ósea, que se representa como resistencia o fortaleza. En los mismos especímenes (vértebras de ratones) se determinaron los parámetros en forma independiente: la resistencia o calidad de hueso se determinó haciendo compresión de las vértebras; la viabilidad de los osteocitos se determinó numerando los osteocitos apoptóticos con la técnica de TUNEL (se detecta el DNA que se halla degradado en cada célula, índice de apoptosis). La masa ósea se determinó por DEXA. La microarquitectura se determinó midiendo los parámetros histomorfométricos. Todos los parámetros contribuyen en forma independiente y conjunta a la calidad del hueso. La cantidad de mineral del hueso aporta el 60% a la calidad del mismo. La viabilidad de los osteocitos contribuye a la calidad ósea independientemente de la cantidad de mineral. Varios trabajos científicos han demostrado que la cantidad de osteocitos apoptóticos en el hueso frágil está aumentada, como sucede en la osteoporosis inducida por glucocorticoides o en la osteoporosis de la posmenopausia. Por otro lado, agentes que protegen al hueso como los bifosfonatos inhiben la apoptosis de los osteocitos (Tomkinson, et al. JCEM 1997. Plotkin, et al. JCB. 1999: 1364-1367).

Repasando el proceso de muerte celular programada o apoptosis, existen lo que se llaman receptores de muerte, por ejemplo receptores para el TNF que activan una enzima llamada la caspasa 8. La caspasa 8 una vez activada promueve la activación de la caspasa 3. Éste es el llamado camino extrínsico de inducción de apoptosis. La caspasa 3 también puede activarse por una vía intrínseca y es activada por factores que están en la mitocondria que activan caspasa 9 que también activa caspasa 3. La caspasa 3 es llamada caspasa ejecutiva porque es la que en definitiva va a degradar sustratros celulares, ya sea de la membrana o del núcleo que en definitiva va a llevar a que la célula llegue a la apoptosis. En la célula apoptótica se ve una fragmentación nuclear por degradación de sustratos nucleares, además se ve una alteración de la permeabilidad de la membrana celular debido a la caspasa 3.

El camino intrínseco y el camino extrínseco están activados en cualquier célula continuamente, a su vez hay otras caspasas que tratan de contraponer este camino de la apoptosis. La paratohormona, inhibe a la apoptosis a través de la proteína kinasa A. En el caso de los esteroides sexuales se demostró recientemente que los ERKS (extracelular signed regulated kinases) y también la phosphositol inositol 3 kinases (PI3K) son los responsables de la sobrevida de las hormonas sexuales.

Los bifosfonatos son compuestos sintéticos análogos del pirofosfato que tienen gran afinidad por el hueso (hidroxiapatita) y que una vez administrados allí se acumulan y lo hacen en la zona de resorción del osteoclasto. Se cree que grandes concentraciones de alendronato entran al osteoclasto e intoxican enzimas del camino del mevalonato y esto inhibiría la formación de proteínas que son importantes para la vida del osteoclasto, por lo que si este camino está inhibido el osteoclasto va a sufrir apoptosis. Como se sabe los bifosfonatos son agentes muy eficaces para tratar la osteoporosis inducida por glucocorticoides. También se sabe que en esta patología hay un aumento importante de la apoptosis de osteoblastos y de osteocitos; además se sabe que la eficacia de los bifosfonatos para tratar estas fracturas es desproporcional al efecto que tienen sobre la densidad ósea.

Además hay evidencia reciente que muestra que los bifosfonatos llegan a los osteocitos.

Esto último llevó a plantear una hipótesis de trabajo: de que los bifosfonatos además de disminuir la vida media de los osteclastos y detener la resorción ósea, parte del efecto podría deberse a un acción antiapoptótica en los osteocitos.

Para comprobar esta hipótesis se realizó un trabajo in vitro con osteocitos de hueso largo de ratón. Estas células fueron trazadas con una proteína la GFP que tiene una secuecia que una vez expresada en la célula se acumula en el núcleo. Cuando estas células fueron tratadas con dexametasona se pudo observar fragmentación nuclear y acúmulos de cromatina (signos típicos de apoptosis). En otro grupo celular que fue pretratado con alendronato se observó que no había apoptosis inducida por dexametasona. Incluso se utilizaron bifosfonatos que no inhibían a los osteoclastos y este efecto protector se mantuvo, por lo que sería un mecanismo distinto al de la inhibición de la vida media del osteoclasto.

Los efectos anti-apoptóticos de los bisfosfonatos fueron confirmados in vivo, en ratones tratados con prednisona en los que se induce un aumento de la apoptosis de los osteocitos y de los osteoblastos y cuando fueron pretratados con alendronato se vio que este aumento era bloqueado.

Los bifosfonatos tienen este efecto antiapoptótico con concentraciones mucho más bajas que las que se requieren para actuar sobre osteoclastos. Se descubrió que los bifosfonatos estimulan la activación de los ERKS, y esta activación es requerida para la antiapoptosis.

También se han hecho trabajos de cómo los estrógenos y andrógenos inducen sobrevida en osteoblastos. En este caso, el mecanismo por el cual inducen sobrevida es mediado por receptores de andrógenos y estrógenos. Los bifosfonatos también activan ERKS para inhibir apoptosis. ¿Cómo lo hacen? No existe un receptor conocido para bifosfonatos, por lo que planteamos que actuarían en forma directa o indirecta a través de canales de conectina. La conectina 43 existe en forma muy abundante en los osteocitos y osteoblastos. Entonces formulamos la hipótesis de que como los bifosfonatos son moléculas de bajo peso molecular éstos podrían entrar en la célula por un canal de calcio, por ejemplo. Estos canales están entre las células y normalmente están cerrados, pero con cambios del ph los mismos se abrirían y comunicarían una célula con otra.

La integridad de los canales de conectina se requiere para que los bifosfonatos estimulen los ERKS y a su vez ejerza un efecto antiapoptótico en los osteocitos. Para demostrar esta hipótesis es que se utilizó un modelo que inhibiera en forma específica a los canales. Se logró esto último desintegrando los canales de conectina y los GAP juntion. O sea que no tenemos ni canales ni hemicanales y utilizamos un inhibidor como la dexametasona y luego que hacemos alendronato o estrógenos vemos que no se inhibe esa apoptosis en el caso del alendronato y sí se inhibe en el caso de los estrógenos que no requieren para su acción de los canales.

Según el anterior trabajo las GAP junction o los hemicanales estarían mediando el efecto antiapoptótico de los bifosfonatos. De manera se trató de cultivar a las células en monocapas a muy baja densidad con lo que se evitaba que una célula se pusiera en contacto con otra de manera que no se formaran los canales, y en esas condiciones se vio que alendronato bloqueaba la apoptosis, esto último nos evidencia que los bifosfonatos tienen su acción antiapoptótica y estimulan ERKS por vía de los hemicanales.

Los bifosfonatos inducían la apertura de los hemicanales. Para demostrar esto se puso una tintura fluorescente en el medio extracelular y luego fue tratada con EGTA, maniobra ésta que reduce los niveles de Ca del medio y se abren los hemicanales y se observó que las células dejaban pasar el colorante hacia adentro cuando estaban en suspensión o cuando estaba adheridas.

También se utilizó alendronato en lugar del EGTA y se reprodujo el pasaje de la tintura por lo que se demostró que los bifosfonatos abren los hemicanales de los osteocitos.

También se ha demostrado que el alendronato necesita de conectina 43 que es muy abundante en el tejido óseo para ejercer su acción antiapoptosis. La conectina 43 tiene, a diferencia de otras conectinas sobre las que no actúan los bifosfonatos, un ancla citoplasmática COOH que se conectaba con alguna otra molécula que su vez activaba ERKS. Uno de los candidatos es una kinasa. La kinasa Src que se sabe que es un activador de ERKS. Posiblemente ERKS puede ser activado por múltiples factores como ser factor de crecimiento, citokinas proteínas de la matriz extracelular.